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[TUTORIAL] Comece a cultivar fungos e bactérias hoje!

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[TUTORIAL] Comece a cultivar fungos e bactérias hoje!

Mensagem por Tanaami em 12/9/2016, 22:11

E ai gente!
Cultivar micróbios é uma coisa muito divertida (pra alguns Razz) e é imprescindível saber essas malandragens quando se quer estudar biologia (e outras áreas também!). O bom é que a maior parte das coisas que a gente vai precisar é super barata e pode ser encontrada em supermercados. Este tutorial é para quem não sabe nada sobre o assunto, mas mesmo para quem já manja, pode ter uma ou outra dica por aí que vai te ajudar da próxima vez. Se você tem alguma dica, deixe ela nos comentários, com certeza irá ajudar muita gente, inclusive eu! Aliás, postem o que acharam sobre esse guia, se está confuso, se falta alguma coisa, eu estou escrevendo com febre e não estou com muita cabeça não.

Existem dois meios básicos de cultivar microrganismos: em meios de cultura sólidos e líquidos. Os sólidos são uma mistura geralmente nutritiva em que vai gelatina, e por isso fica sólido. É muito útil, pois se houver algum contaminante, nós podemos separar simplesmente cortando um pedaço da colônia que nos interessa e colocar em outra gelatina limpa. Já os meios de cultura líquidos não tem essa vantagem (se contaminar, você perderá a cultura inteira, pois não dá pra separar o contaminante). Apesar dessa desvantagem, meios líquidos são muito úteis, pois é fácil inocular usando um líquido, e se você for produzir alguma substância, como alguma proteína, DNA ou metabólito, uma cultura líquida ira render muito mais.

Para cultivar micróbios (sejam bactérias, fungos, microalgas) uma coisa é essencial: assepsia (não é aquele remédio pra espinha não, é higiene mesmo). Os microrganismos estão espalhados em todo lugar, nos objetos, na água, até no ar que respiramos. Por isso, se você simplesmente fizer uma gelatina nutritiva e tentar cultivar algo nela, sem esterilizar ou usar procedimentos assépticos, irá crescer uma selva multicolorida e fedida de bactérias e fungos diversos, e dificilmente você irá conseguir trabalhar com aquele ser vivo específico que você queria. Por isso, tudo que entrar em contato com meio de cultura deve ser esterilizado, e o ambiente de trabalho, limpo com esterilizantes, como álcool 70%, água sanitária, lysol ou ácido peracético. Devemos sempre usar luvas e higieniza-las sempre, usando algum desses produtos. Devemos também evitar coçar, espirrar e passar a mão no cabelo enquanto trabalhamos, afim de evitar contaminar o trabalho e de o trabalho contaminar você.


(A tintura de iodo e a água oxigenada servem para fazer a esterilização superficial de amostras vivas selvagens que eventualmente coletaremos da natureza e cultivaremos no laboratório, como cogumelos, sementes e folhas)

Bom, agora que sabemos do geral, vamos ao que interessa!

Você precisará de um recipiente para colocar o líquido nutritivo. Se for meio sólido, você pode usar desde potes de geléia, placas de Petri já estéreis ou placas de Petri de vidro. Potes de polipropileno também servem, mas se certifique que são 100% PP, pois se for outro plástico, ele derreterá na esterilização na panela de pressão. Se for meios líquidos use potes de palmito, ou então tubos falcon e eppendorf, próprios para isso.



Se você for usar potes, você pode por o meio de cultura neles e esterilizar os potes já com o meio. Já com Petris, você precisará por o meio depois de esterilizar ambos (as placas e o meio de cultura).
Se você for usar placas de Petri (o que eu altamente recomendo, pois potes usam muito espaçoe são ruins de visualizar e trabalhar), eu recomendo as de plástico. Elas já vem estéreis, e é muito mais fácil de manipular do que as de vidro. As de vidro são boas, mas são frágeis e desengonçadas, já perdi vários trabalhos as deixando cair porque elas não dão firmeza quando você as segura. Mas se você mesmo assim for usá-las, precisará esterilizá-las. É possivel esterilizar no forno, apenas embrulhando as placas em papel alumínio e deixando por 20 minutos em um forno pré-aquecido, ou então em panela de pressão, que é o jeito que eu uso, pois o meio de cultura precisa ser esterilizado na panela, e assim eu gasto menos gás. Nesse caso, ao invés de embrulhar as placas em papel alumínio, eu simplesmente as coloco em um pote. Eu ponho as placas invertidas, viradas para baixo, pois na hora de abrir o pote para colocar o meio de cultura nas placas, tudo vai ficar mais fácil (é difícil tirar as placas de dentro do pote, é mais fácil virar o pote inteiro e tirar o pote como se fosse uma tampa, como mostra a segunda imagem abaixo Very Happy )






Sobre o meio de cultura. Existem centenas de receitas para eles, muitas exóticas, podendo entrar sangue, ração de cachorro, peixe, entre outras coisas. Alguns são mais apropriados para bactérias, outros para fungos, outros servem para selecionar, outros para induzir determinados fenótipos, enfim, existem muitos. O que eu mais uso com certeza é o BDA (Batata, Dextrose, Ágar), e é um dos mais populares e fáceis de fazer. A receita original pede para você usar a água do cozimento de batatas fatiadas, mas como eu sou preguiçoso eu uso uma variação dessa receita, em que a batata é trocada por flocos de batata (aqueles que servem para fazer purê instantâneo só misturando com água!). A dextrose, também conhecida por glicose, eu comprei em farmácia de manipulação, acho que paguei 3 reais nesse pote, que está durando muitos meses, mas você pode usar aquela glucose de milho Karo. O ágar eu achei na seção de produtos japoneses de um mercado.



Para fazer essa receita, você deverá usar 10g de flocos de batata, 20g de dextrose e 15g de ágar (o ágar é a gosto, para deixar mais macio você usa menos, e para deixar mais consistente, use mais gelatina). Misture os pós e adicione água morna até completar 1 L. Agora você já pode colocar na garrafa e esterilizar na panela de pressão. Aliás, eu uso duas garrafas, uma que era de leite de côco, e outra que era de Coca-cola, dependendo da quantidade que vou fazer. É importante que quando você for despejar com a garrafa o líquido não escorra pela borda, e que ele não seja tão grosso a ponto de você não conseguir segurá-lo com firmeza usado luvas molhadas escorregadias. É bom tampar a garrafa com papel alúminio, de modo que não fique tampado (se você colocar algo tampado em uma panela de pressão ele irá implodir! Sempre deixe recipientes levemente abertos quando for colocar na panela de pressão!) mas também não evapore muita água, ou não caia água dentro da garrafa.



Agora é só colocar na panela de pressão e esterilizar! É bom colocar algo no fundo da panela, para evitar o contato direto do fundo com o vidro e plástico, o que pode causar quebras e deformações. Eu uso um pano de prato. O nível de água na panela não precisa ser muito alto não, uns 3 dedos acima do fundo está ótimo (mas preste atenção, pois se acabar a água, acredito que irá acontecer um acidente!). Cada receita possui um tempo de esterilização. Para o meio BDA que eu faço geralmente, deixo o fogo aceso por 35 minutos após a panela pegar pressão.



Após o tempo acabar, apague o fogo e deixe esfriar até ficar morno. Se esfriar completamente, a gelatina vai ficar dura e você não conseguirá tirar da garrafa. Aproveite o tempo para organizar e limpar seu local de trabalho, tomar um banho, revisar todos os procedimentos que você irá seguir, e escutar um álbum daora.
Ao ficar morno, coloque luvas, e limpe as luvas, os braços e a panela com álcool 70% ou outro líquido sanitizante. Coloque o conteúdo da panela organizadamente no local de trabalho, e despeje o meio de cultura nas placas de acordo com a técnica abaixo:



Para evitar condensação, deixe a gelatina esfriar o máximo possível antes de despejar ela. E antes de inocular algo espere esfriar até a temperatura ambiente! Falando em inocular, você precisará de algumas ferramentas:




  • Palitos de dente (estéreis, por favor!) são muito úteis para pegar colônias pequenas. Sempre tenha uma caixa por perto. Para esterilizar, apenas pegue um bocado deles e coloque em um pote de geléia e esterilize junto com o meio de cultura.
  • Alça de inoculação serve para espalhar um líquido (geralmente com esporos ou células vivas) na superfície do ágar. Se você tiver técnica suficiente pode até desenhar umas coisas bonitinhas com bactérias na placa de petri! Eu fiz a minha alça (mostrada no meio da imagem) torcendo um arame bem fino e prendendo com fita adesiva em um tubo de caneta.
  • Bisturi é útil para cortar um pedaço de gelatina colonizada e inocular outra placa com esse pedaço
  • O rolo de filme PVC é cortado em pedaços, e esses rolos menores são usados para lacrar as placas de petri (elas não podem ficar abertas, senão contamina). Duas voltas são suficientes.
  • Fita microporosa é usada para vedar a placa quando o microorganismo precisa de muito oxigênio (faça pelo menos umas 3 camadas, pois a fita é bem permeável)
  • Seringa é boa para medir líquidos, fazer diluições seriais (se você não tiver uma micropipeta), inocular com líquidos, transferir meios, etc
  • Alça de Drigalski, feita com um arame grosso  e tubo de caneta, serve para espalhar uniformemente um líquido em um meio de cultura.


Algumas dessas ferramentas precisam ser esterilizadas, como a o bisturi e as alças. Para isso, é usado fogo. Velas e isqueiros, apesar de funcionarem, deixa a ferramenta suja com uma fuligem preta (além de que é muito perigoso usar um isqueiro com a luva cheia de álcool!), por isso é recomendável uma lamparina a álcool:



Ela é simplesmente um pote de vidro com uma tampa metálica furada, e um pavio feito de tecido de algodão. O álcool pode ser o do posto de gasolina mesmo (95% mais ou menos). Para apagar, coloque uma tampa, assoprar não funciona. Eu uso um pedaço de papel alumínio, que já serve pra guardar e evitar a evaporação do álcool.

Para esterilizar a ferramenta passe ela algumas vezes por alguns segundos no fogo, e espere esfriar antes de usar. Para as alças, é recomendado tocar no meio de cultura antes de tocar no microrganismo, para se ter certeza de que ela está fria e não vai matar o que você quer cultivar.

Bom, por hoje vou ficar por aqui mesmo. Se eu me lembrar de mais alguma coisa eu adiciono aqui. Não esqueçam de deixar suas sugestões e críticas! Se alguém usar este tutorial, por favor, conte como foi, se sentiu dificuldade em algum procedimento, se mudaria alguma coisa!


Última edição por Tanaami em 9/10/2016, 00:38, editado 1 vez(es)

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Re: [TUTORIAL] Comece a cultivar fungos e bactérias hoje!

Mensagem por lucaslucas em 13/9/2016, 12:57

Obrigado!

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Re: [TUTORIAL] Comece a cultivar fungos e bactérias hoje!

Mensagem por Victor Farinella em 7/10/2016, 09:49

Muito bom o tutorial!

Eu fiquei pensando em uma coisa... O cultivo de microorganismos tem alguma finalidade além de ser muito legal?
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Re: [TUTORIAL] Comece a cultivar fungos e bactérias hoje!

Mensagem por Tanaami em 8/10/2016, 01:09

Victor Farinella escreveu:Muito bom o tutorial!

Eu fiquei pensando em uma coisa... O cultivo de microorganismos tem alguma finalidade além de ser muito legal?

Com certeza Victor! Se você não é um cientista, você poderia cultivar cogumelos comestíveis e medicinais, ou ainda usando técnicas bem parecidas, fazer culturas de tecidos vegetais, podendo a partir de uma única planta criar centenas de outras plantas clone, o que é muito útil quando as plantas produzem poucas sementes e são difíceis de se criar por mudas, por exemplo, entre várias outras aplicações. Se você for levar para o lado científico, a maioria das técnicas de biologia sintética ou biologia molecular envolvem em alguma etapa criar microrganismos em placas de Petri. Por exemplo, vamos supor que você inseriu um gene em uma bactéria. Como o processo não é perfeito e nem todas as bactérias absorveram o gene, você insere também um marcador, ou seja, um gene que torna a bactéria resistente a um certo antibiótico. Na placa de Petri, além do meio de cultura, você mistura este antibiótico, e assim quando vc inocula as bactérias na placa de Petri, somente irão formar colônias que absorveram o gene, facilitando muito a nossa vida! Outro exemplo: imagine que você quer descobrir que tipos de microrganismos vivem no solo. Você simplesmente pegaria uma amostra deste solo, diluiria ele em água, e inocularia em uma placa de Petri. Assim, irão crescer várias colônias, e através de sequenciamento de DNA ou usando chaves dicotômicas, é possível identifica-las. Existem milhares de outras aplicações, eu poderia ficar o dia inteiro aqui enumerando elas, mas acredito que estas sejam as principais.

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Re: [TUTORIAL] Comece a cultivar fungos e bactérias hoje!

Mensagem por Victor Farinella em 9/10/2016, 13:55

Ah sim, a "parte científica" eu tinha uma ideia, mas a parte dos fungos e da cultura de tecidos vegetais em casa eu não conheço muito!

O cultivo de cogumelos comestíveis é facil aqui no Brasil? Digo, dá pra conseguir, substrato, esporos e etc a um preço acessível?
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Re: [TUTORIAL] Comece a cultivar fungos e bactérias hoje!

Mensagem por Tanaami em 9/10/2016, 17:35

Sim! O Shimeji (Pleurotus ostreatus) por exemplo, pode ser isolado a partir de um cogumelo comprado no supermercado, aqueles que vendem em bandejinha! Esterilize a superfície do cogumelo com água oxigenada, rasgue ele ao meio e corte com um bisturi um pequeno pedaço da parte interna, para evitar contaminação, e coloque em uma placa de Petri com BDA. Quando crescer, corte um pedaço grande do ágar e chacoalhe com água estéril em um pote de vidro. Use essa água pra inocular potes de centeio estéril* e aguarde colonizar. Ao colonizar use esses potes para inocular sacos com serragem ou papel pasteurizado, e quando colonizar, fure os sacos e ponha em condições de frutificação. Eu não posso dar mais detalhes a partir da parte do centeio pois nunca cheguei nesse estágio, mas acredite, não é difícil! Very Happy

*Para esterilizar o centeio, cubra o centeio com água quente de um dia pro outro, depois ferva de novo por 10 min e em seguida escorra muito bem, para deixar bem seco. Em seguida coloque os grãos em potes e esterilize por 1h30 na panela de pressão.

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Re: [TUTORIAL] Comece a cultivar fungos e bactérias hoje!

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