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CRISPR: entenda como funciona a ferramenta que está revolucionando o mundo!

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CRISPR: entenda como funciona a ferramenta que está revolucionando o mundo!

Mensagem por Tanaami em 17/9/2016, 23:57

Texto baseado em https://www.addgene.org/CRISPR/guide/. As imagens também foram retiradas de lá! Para quem sabe inglês, visite esse site, ele tem bastante coisa útil!

E ai galera!
Hoje vou falar um pouco sobre o hype do momento, o CRISPR-Cas9, que muita gente já ouviu maravilhas que prometem revolucionar o mundo, ou o extremo oposto, que essa é a nova bomba de hidrogênio, que é a arma do apocalipse e essas paradas. E de um certo modo, os dois lados estão certos: essa tecnologia é tão incrível que nem parece ser verdade, mas até embriões humanos já foram editados usando essa ferramenta Shocked ! (Tá, a parte em que o CRISPR está revolucionando o mundo é verdade, mas ele não é o fim da humanidade não, posso tentar explicar o porque em outro post, pq aqui geraria muita treta e foge do escopo) Bom, chega de lero lero e vamos ao que interessa.

O CRISPR-Cas9 (sigla em inglês para grupo de repetições palindrômicas curtas regularmente inter espaçadas) é uma ferramenta descoberta em 2012, e que como muitas outras, já existe na natureza a muito tempo (sim, ele não é uma invenção humana!). Na engenharia genética, ela pode ser usada para inativar genes (knock-outs), aumentar ou diminuir a expressão, purificar regiões específicas do DNA, fazer inserções e deleções, e até fazer imagens do DNA em células vivas através de microscopia por fluorescência, dentre outras aplicações. Nas bactérias, ele tem papel protetor contra vírus invasores, quebrando e inutilizando o DNA forasteiro, evitando assim o ataque e possível morte. Apesar do nome comprido e complexo, este sistema funciona de uma maneira lindamente simples. Ele é composto de duas partes: uma fita de RNA que contém uma sequencia complementar ao DNA dos predadores, chamada de gRNA (g vem de guia), e o Cas9, uma enzima nuclease (ou seja, que corta o DNA).

No sistema imunológico bacteriano, o gRNA serve para identificar o inimigo com relativamente alta precisão, e guiar o Cas9 até o local para fazer o corte. O CRISPR funciona por homologia: o gRNA "procura" a sequência alvo se ligando a ela, pois tem sequência complementar. O gRNA pode ser dividido em duas regiões: o "espaçador", que é a região complementar ao DNA alvo, e é personalizada pelo usuário, e também um "esqueleto" em que a nuclease se ligará, formando um conjunto gRNA + nuclease.

Quando o conjunto gRNA + Cas9 finalmente encontra a sequência complementar ao espaçador, ele se liga ao DNA, e o Cas9 realiza o corte (na verdade, além da sequencia alvo, também deve existir em seguida o PAM, um curto conjunto de bases que são necessários para que o Cas9 se ligue ao DNA; para o Cas9, o PAM é 5' NGG 3', e está mostrado em laranja nas imagens). A nuclease selvagem corta as duas fitas do DNA, pois possui dois sítios ativos, mas cientistas já modificaram a Cas9 para inativar um ou os dois sítios, realizando apenas um corte (nick) ou ainda nenhum corte, deixando a proteína "morta", apenas ligada ao DNA. Essas duas novas nucleases se chamam Cas9 nickase e dCas9, respectivamente, e são muito úteis, como iremos ver.



Após o corte, duas coisas podem acontecer. O DNA pode ser religado por ligação não homóloga ou por ligação homóloga. A não homóloga, que acontece mais frequentemente, é mais suscetível a erros, como inserções e deleções aleatórias de base, e por isso pode-se ser usada para fazer knock outs, através da Cas9 selvagem. Já o reparo por homologia é bem mais preciso, e tem mais aplicações práticas, como fazer edições (como adição de um nucleotídeo e até de grandes pedaços de DNA). Para se fazer um reparo por homologia, deve-se usar a Cas9 nickase, e dois gRNA, um para a sequencia acima e o outra pra baixo do local que se quer editar, cada um para uma das fitas, como mostra a imagem abaixo:



Como pode-se ver, formam-se dois "braços" de DNA de cadeia simples. Eles que serão usados para fazer o reparo por homologia, e para isso, devemos usar também um pedaço de DNA que contenha o que queremos inserir, e o complementar a esses braços. Assim, existe uma chance desse oligonucleotideo que inserimos na celula se ligar a esses braços e realizar a inserção do DNA que queremos inserir. Note que não esse oligonucleotídeo não deve conter o PAM, senão ele também será alvo do CRISPR!

Para se alterar a expressão de algum gene, pode-se usar o dCas9. Como essa nuclease não realizará cortes, não é uma modificação permanente, e pode ser revertida para o estado anterior. Para usá-la para essa finalidade, o gRNA deve ser projetado para se ligar ao promotor do gene. Assim, se o conjunto gRNA + dCas9 se ligar, ele impedirá os fatores de transcrição de se ligarem, e abaixará o nível de expressão. Também foram feitos dCas9 com repressores e ativadores de transcrição, aumentando ainda mais a eficiência dessa ferramenta, e possibilitando também aumentar a a expressão do gene, ao invés de diminuir.



Existem muitos outros usos interessantes para o CRISPR, bem como outras nucleases, e talvez, dependendo do sucesso do fórum (ou se alguém pedir) posso colocar mais material aqui (se eu souber, pois não sou nenhum especialista hahaha), mas por enquanto vou mostrar só esses.
Abraço, e bom biohacking a todos! Very Happy

Tanaami
Admin

Mensagens : 52
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